mikroskop

Synligt lys er en form for elektromagnetisk stråling med bølgelængder fra omkring 380 nanometer (nm) til 750 nm. Lysmikroskoper anvendes med bølgelængder fra ca. 100 nm (ultraviolet) til ca. 1000 nm (infrarødt). Den nedre grænse for opløsningsevnen for de fleste typer af lysmikroskoper er givet ved bølgelængden og i praksis ikke mindre end 200 nm. Der er dog udviklet særlige mikroskoper med såkaldt superopløsning, dvs. opløsning for helt særlige tilfælde, der er langt under den såkaldte diffraktionsgrænse.

Der er udviklet en lang række typer af lysmikroskoper, og inden for hver type er der adskillige varianter:

• Almindeligt lysmikroskop (bright field).
• Fasekontrast, hvor transparente objekter kan visualiseres.
• Mørkefelt (Dark field), hvor en lysende baggrund fjernes så små variationer i planen vinkelret på den primære strålegang visualiseres bedre.
• Differentiel interferens, hvor små højdeforskelle eller små forskelle i brydningsforholdet i stråleretningen visualiseres.
• Stereo, opsamling af lys fra lidt forskellige retninger så et tredimensionalt billede fremkommer.
• Fluorescens, hvor lys opsamles ved en anden – normalt lavere – bølgelængde end belysningsbølgelængden.
• Polarisation, hvor polarisationsforhold som bl.a. dobbeltbrydning udnyttes.
• Konfokale mikroskoper er baseret på en skanning af en fokuseret laserstråle med opsamling af lys fra det fokale område. Kan give tredimensionale billeder med meget høj opløsning.
• Superopløsning. Ved anvendelse af flere bølgelængder og udnyttelse af bl.a. fluorescens er det muligt under særlige forhold at opnå en opløsning langt mindre end bølgelængden.

Desuden findes der skannende mikroskoper, som fx kan anvendes til undersøgelse af celler in situ, dvs. uden at emnet er placeret i et meget tyndt lag mellem to glasplader.

Ud over lysmikroskoper findes der en række andre typer af mikroskoper (som ikke omtales nærmere i denne artikel):

• røntgenmikroskoper, baseret på elektromagnetisk stråling med meget korte bølgelængder (få nanometer);
• elektronmikroskoper, baseret på elektronstråling med en ekstremt kort bølgelængde (nogle få picometer, 10^-12m);
• akustiske mikroskoper, baseret på ekstremt højfrekvent lyd; og
• skannende nærfeltsmikroskoper som bl.a. AFM-mikroskoper og scanning-tunnelmikroskoper (STM-mikroskoper). Her er princippet en mekanisk skanning (piezoelektrisk) af en probe, som styres til en ekstremt kort afstand til strukturen i objektet via en nærfelt eller tunneleffektkobling; atomar opløsning er mulig.

Lyskilden er ofte en halogenlampe, men bliver i stigende omfang erstattet af LED-lyskilder. Til fluorescensmikroskoper anvendes buelamper baseret på kviksølv, xenon eller metal-halogen. Det er almindeligvis ønskeligt, at lyskilden er delvis inkohærent for at undgå såkaldt speckle-støj. Laserlys anvendes kun i helt specielle tilfælde.

Ultraviolet lys anvendes for at opnå bedre opløsning. Her skal billedet registreres af et uv-kamera. Ikke alle objekter tolererer uv-belysning.

Infrarødt lys kan anvendes i tilfælde hvor objektet helt blokerer synligt lys.

Lyset fra lyskilden bliver kollimeret og fokuseret på objektet med en såkaldt kondenser optik og således, at det svarer til objektivet i mikroskopet.

Objektet er almindeligvis en udskåret del af det element, som ønskes undersøgt. Udskæringen er normalt et meget tyndt lag (nogle mikrometer, μm) placeret mellem to tynde helt plane glasplader objekt- og dækplade). Ofte er det små objekter i en væske, der ønskes undersøgt. Væsken kan placeres mellem glaspladerne og forbliver der pga. hårrørsvirkningen og overfladespændingen. Objektet er ofte helt transparent og derfor er indfarvning almindeligt anvendt således, at forskellige dele af objektet indfarves forskelligt. Derved bliver objektet synligt i et almindeligt lysmikroskop.

Lyset fra objektet opsamles af et linsesystem kaldet objektivet. Objektivet fastlægger sammen med lysets bølgelængden den nedre grænse for opløsningsevnen (hvor små detaljer der kan observeres). Den angives almindeligvis til d = λ/(k na), hvor λ er bølgelængden og na den numeriske apertur. k er en konstant, som ofte er fastlagt til k = 2. Den numeriske apertur er givet ved det vinkelområde, hvor lys kan opsamles af objektivet multipliceret med brydningsforholdet for væsken (eller luften) mellem objekt og objektiv (se Figur 3).

Opløsningsevnen er her givet ved den såkaldte diffraktionsgrænse. Dette kræver et meget velkorrigeret objektiv. En simpel linse vil udvise flere former for aberrationer, der medfører en væsentlig ringere opløsningsevne. Ved kombination af flere linser baseret på materialer med lidt forskellige brydningsforhold er det imidlertid muligt at opnå diffraktionsbegrænset opløsning. Linser med asfæriske (ikke kugleformede) overflader kan også anvendes, men har været vanskelige at fremstille i høj kvalitet.

For at opnå en meget høj opløsning er objektivet ofte neddyppet i en olie på glaspladen over objektet. Olien har et brydningsforhold tæt på glassets og medfører en forøgelse af den numeriske apertur.

Det forstørrede billede kan optages med et kamera evt. med en særligt tilpasset optik. Det kan også tilpasse øjet ved hjælp af et okular.

Okularet tilpasser strålegangen, således at der dannes et stærkt forstørret billede på nethinden. Okularet bidrager også til forstørrelsen. Ofte er tilpasningen til øjet udført med to okularer samt et prisme og stråledeler-arrangement, således at det forstørrede objekt kan ses med begge øjne. Dette kaldes et binokulært mikroskop.

Et stereomikroskop eller en stereolup er sammensat af to monokulære mikroskoper, hvis akser konvergerer med en lille vinkel mod præparatet. Objektet ses derfor samtidig med de to øjne fra to lidt forskellige vinkler, hvorved billedet får rumlig dybde. Stereomikroskoper konstrueres med stor arbejdsafstand (afstanden mellem objektiv og objekt). Opløsning og forstørrelse er moderate, ofte op til 60-100 gange, men tilstrækkelige som hjælp ved manuelt arbejde med små objekter, fx i mikrokirurgi, elektronik og finmekanik.

Objektivet er i de fleste mikroskoper anbragt over objektet, og kondensoren under. I et omvendt mikroskop betragtes objektet nedefra, hvilket er praktisk ved mikroskopi af objekter, der ligger i en væske i en lille skål, fx en cellekultur.

Figur 4 viser den praktiske opbygning af både det almindelige lysmikroskop og fluorescensmikroskopet samt betydningen af immersionsolie mellem objektiv og dækglas.

Objektet kan give både en rumlig varierende dæmpning af lyset og en varierende forsinkelse af lyset. Hvis det sidste er dominerende, er objektet helt transparent og det karakteriseres som et faseobjekt. Dette er ofte tilfældet for biologiske objekter, hvor brydningsforholdet er varierende. Indfarvning kan være en mulighed, men i mange tilfælde undgås dette fx ved undersøgelse af levende celler. Imidlertid forholder det sig sådan, at med et lysstærkt velfokuseret objektiv er det (næsten) ikke muligt at se et rent faseobjekt. En løsning på dette problem blev anvist af Frits Zernike (der modtog Nobelprisen i 1953).

Et objekt med små variationer i faseforsinkelsen (meget mindre end π radianer, 90 grader) hen over objektet vil sprede (diffraktere) lidt af det indkomne lys, mens det mest bliver transmitteret uændret. Det viser sig så, at det diffrakterede felt er (omtrent) i fasekvadratur med det direkte transmitterede felt, hvilket betyder, at de to felter ikke interfererer. Det, øjet ser, er givet ved kvadratet på feltet midlet over nogle få oscillationer af feltet. Derfor er det svage diffrakterede lys næsten usynligt.

Men hvis fasen af enten det diffrakterede lys eller af det transmitterede lys ændres med π/4 (90 grader), vil de to felter have samme fase, og i kvadratet på feltet fremkommer et produktled, hvor det svage lys er forstærket ved multiplikation med feltet fra det stærke direkte transmitterede lys.

I et fasekontrastmikroskop realiseres dette på følgende måde: i kondenseroptikken indsættes en ringformet blænde og umiddelbart efter objektivet indsættes en plade med en ringformet forsinkelse af det direkte transmitterede lys på en kvart bølgelængde (som giver π/4 faseforsinkelse). Desuden bliver det direkte transmitterede lys normalt også dæmpet, hvilket kan forøge kontrasten. Figur 6 viser eksempler på optagelse med bright field og med fase-kontrast.

Det bemærkes, at en misfokusering kan synliggøre fasevariation, men opløsningen bliver væsentlig forringet og anvendes derfor ikke i lysmikroskoper, men metoden har fundet anvendelse i bl.a. transmissions-elektronmikroskoper.

Mørkefelt-mikroskopet anvendes også til visualisering af objekter, som dårligt kan observeres med det almindelige lysmikroskop. Det er dog ikke helt de samme strukturer i objektet, som bliver fremhævet.

I mørkefeltmikroskopet blokeres det ikke spredte lys således, at små objekter fremtræder på en mørk baggrund i billedplanen. Dette kan enten gøres med en blokerende blænde i objektivet eller – normalt – ved at belyse objektet under så skrå en vinkel, således at det direkte transmitterede lys ikke rammer objektivet. Figur 6 viser et spetakulært billede hvor strukturer er fremhævet på en mørk baggrund. Med bright ville strukturerne fremtræde meget svagt.

Differential interferens-kontrastmikroskopet kaldes også et Normarski-mikroskop. Det kan også anvendes til visualisering af små fasegradienter, men der er væsentlige forskelle i forhold til fasekontrastmikroskopet. Fx anvendes DIC-mikroskopet i reflektionstilstand til undersøgelse af strukturen i integreret elektronik (mikroelektronik). Til dette formål er fase-kontrast princippet mindre egnet. DIC-mikroskopet anvendes også til undersøgelse af en række biologiske objekter.

Princippet i et DIC-mikroskop er følgende:

• Polariseret lys i kombination med et særligt dobbeltbrydende prisme frembringer to billeder med en meget lille forskydning – typisk svarende til opløsningen i mikroskopet.

• Ved anvendelse af et polarisationsfilter vil lys fra nabopunkter interferere. Hvis lyset har samme fase fra to punkter, vil intensiteten blive forstærket, mens den vil blive udslukket, hvis lyset fra de to punkter er i modfase. Faseforskellen kan være bestemt af højdeforskelle i objektet (refleksion).

• Gradienter i højdeforskellene vil derfor fremkomme i billedet. Ved transmission vil små variationer i brydningsforholdet fremkomme som intensitetsvariationer i billedet.

I ultravioletmikroskopet opnås en noget højere opløsning, ca. 0,1 μm på grund af lysets kortere bølgelængde, men linserne skal fremstilles af specielle glassorter, og billedet må registreres med et kamera, da ultraviolet lys ikke opfattes af øjet. Infrarødmikroskopet udnytter, at visse materialer, der er uigennemtrængelige for synligt lys, er gennemtrængelige for infrarødt lys, men oftest må billedet registreres med et kamera.

En farvet objektdetalje virker som et optisk filter, der kun tillader passage af lys af bestemte bølgelængder, og vil derfor billeddannes med disses farver. Dette udnyttes bl.a. ved undersøgelser af celler og væv, og hertil er udviklet et stort antal farvemetoder, der selektivt farver forskellige komponenter i præparatet; se histokemi og histologi.

I fluorescensmikroskopet, der ligeledes finder udstrakt anvendelse i biologiske studier, udnyttes den egenskab ved en række farvestoffer, at de fluorescerer, dvs. at de ved belysning (excitation) med lys af en bestemt bølgelængde udsender (emitterer) lys med en anden (altid længere) bølgelængde, der er præcist defineret af farvestoffet.

I moderne fluorescensmikroskoper belyses det farvede præparat gennem objektivet ved hjælp af et skråtstillet spejl, der har den egenskab, at det reflekterer det kortbølgede, exciterende lys, som kastes ind fra siden, men lader det lys passere, der ved fluorescens emitteres fra præparatet, mens det exciterende lys reflekteret fra præparatet spejles ud af strålegangen. Ved fluorescensmikroskopi fremtræder objektet som selvlysende. Ligesom i mørkefeltmikroskopet er det derfor muligt i et fluorescensmikroskop at synliggøre strukturer, hvis størrelse er langt under mikroskopets opløsningsevne.

I polarisationsmikroskopet undersøges ved hjælp af en polarisator anbragt under kondensoren og en anden polarisator (analysatoren) anbragt under okularet, om strukturer i objektet har egenskaber, der påvirker lysets polarisationsretning. Polarisationsmikroskopet finder især anvendelse i mineralogi og ved tekniske materialeundersøgelser.

Det konfokale scanningmikroskop kan anvendes til frembingelse af tredimensionale billeder af små delvist transparente objekter som fx biologiske celler. Det er også meget velegnet i forbindelse med fluorescens.

Princippet er følgende:

• En laserstråle fokuseres på/i objektet.
• Det spredte lys fra fokalområdet opsamles på et såkaldt pinhole med en diameter, der svarer til laserstrålens fokale diameter.
• Den detekterede lyseffekt fra pinhole't detekteres som funktion af fokalområdets position i tre dimensioner (scanning).
• Et tredimensionalt billede frembringes.

Ved anvendelse af specielle spejle og filtre kan lys udsendt samtidig fra forskellige fluorescensfarver i det samme præparat adskilles og registreres i hver sin detektor og afbildes simultant i digitalbilledet. Ved systematisk at ændre præparatets afstand fra objektivet kan der optages en serie billeder, der hver repræsenterer et optisk snitplan i præparatet. Mikroskopet har fået en vigtig plads i biologien, dels fordi det tillader simultan billeddannelse af forskellige strukturer, der er selektivt mærkede med forskellige fluorescensfarver, dels fordi det muliggør afbildning med høj opløsning i optiske snit af tykkere præparater, fx hele celler.

Det konfokale mikroskop kan anvendes i en modificeret udgave, hvor såkaldt to-foton- eller multi-foton-vekselvirkning benyttes. En tilstandsovergang, der kræver eksitation med en energi større en enkel-foton energien kan eksiteres ved, at to eller flere fotoner sammen eksiterer tilstanden. Dette er muligt fordi mange fotoner kan være i samme kvantemæssige tilstand. Der kan herved opnås en bedre opløsning og dybere indtrængning i objektet for tredimensionale billeder. Desuden vil bølgelængden af det opsamlede lys være kortere end bølgelængden svarende til en enkel eksitations-foton – i modsætning til forholdene ved almindelig fluorescens. Som lyskilde kræves en kraftig pulseret laser.

Mange materialer er optisk ulineære. Det kan betyde, at der ved belysning med en bølgelængde (ofte infrarød) vil fremkomme lys med den halve bølgelængde. Dette er veldokumenteret for en række uorganiske materialers vedkommende. Imidlertid viser det sig, at også flere biologiske materialer udviser en sådan effekt, og det kan anvendes til mikroskopi uden indfarvning.

Der har været udført mange forsøg på at bryde diffraktionsgrænsen for et mikroskops opløsningsevne, men overvejende uden held til at anvise et brugbart instrument. Men i 2014 fik den amerikanske fysiker Eric Betzig (født 1960) og hans rumænsk-tyske fagfælle Stefan W. Hell (født 1962) sammen med den amerikanske kemiker William E. Moerner (født 1953) Nobelprisen i kemi for i 1999 at have demonstreret optiske metoder til billeddannelse af celler med en opløsning ned til 50 nm, dvs. langt under den klassiske diffraktionsgrænse.

Princippet er baseret på det forhold, at fluoroforers (stoffer der udviser fluorescens) lysudsendelse kan blokeres ved kraftig belysning. Derved kan det område, som udsender lys i princippet begrænses til nanometer-området. I praksis er der demonstreret opløsning under 50 nm – som er væsentligt mindre end de 200 nm, der betragtes som nedre grænse for et klassisk lysmikroskop.